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    普通PCR簡述

    Brief introduction of ordinary PCR

    1、發展簡史

    20世紀60年代末70年代初,人們致力于研究基因的體外分離技術。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想。但是,當時的基因序列分析方法尚未成熟,對熱具有較強穩定性的DNA聚合酶還未發現。1985年,美國科學家Kary Mullis發明了PCR技術,并在Science雜志上發表了關于PCR技術的第一篇學術論文。從此,PCR技術得到了生命科學界的普遍認同,Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。1988年初,Keohanog通過對所使用的酶的改進,提高了擴增的真實性。爾后,Saiki等人又從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到一種耐熱的DNA聚合酶,使得PCR技術的擴增效率大大提高。

    2、技術原理

    DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子挎貝。

    在聚合酶鏈式反應實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,并設計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。( DNA高溫變性低溫復性)

    發現耐熱DNA聚合同酶#Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,并逐步應用于臨床。

    3、普通PCR反應流程

    4、反應原理

    5、PCR循環

    6、與熒光定量PCR技術相比較主要缺點

    1、常規PCR結合電泳分析方法的缺點

    2、只能對終產物進行分析,無法對起始模版準確定量

    3、必須在擴增反映結束后借助電泳方法分析,費時費事

    4、無法對擴增反應實時檢測

    5、EB有毒

    熒光PCR簡述

    1、發展簡史

    定義:在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號的變化,通過儀器軟件實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化,通過Ct值和標準曲線實現對起始模板的定量分析。

    2、熒光PCR檢測分為兩種方法:

    熒光探針法和熒光染料法。

    3、熒光探針法檢測原理:

    4、熒光PCR如何實現實時監控的呢?

    → PCR反應體系中加入熒光染料

    → 所有的定量PCR儀器都有三個共同的組成部分(檢測器、激發光源、熱循環模塊)

    → 在擴增過程中,熒光信號隨著PCR產物的增加而增強

    → 每個循環結束后,定量PCR儀器通過光學系統記錄熒光信號的增加

    → PCR軟件計算出數據,用于實驗結果的分析

    → 蘇州曠遠產品技術平臺:ARMS檢測方法;1個SNP位點設計雙管反應,含目的基因檢測及內參檢測雙通道。


    5、技術特點:

    →準確可靠,臨床雙盲對照試驗>1000例,結果與金標準測序法比對,結果一致性大于99%。

    → 高靈敏:可檢測低至10ng的人基因組DNA。

    →快速:整個檢測流程只需3小時。

    →簡便:試劑盒提供預混好的試劑,使體系配置操作簡便。

    →防污染

    →高特異性:雙重特異性組成,保證檢測結果的特異性和準確性引物與DNA互補鏈結合必需完全配對,才能延伸。探針特異性與所檢測基因的PCR產物配對,在延伸中產生熒光。

    6、臨床基因檢測技術比較:

    方法

    原理

    適用

    優點

    弱點

    操作

    準確性

    市場應用

    DNA芯片

    PCR-芯片雜交

    多位點

    多基因,多為點同時

    少數位點

    步驟多,易污染

    較高

    臨床使用

    PCR-RFLP

    PCR-酶切-電泳

    SNP位點

    多位點

    步驟多,易污染

    較高

    逐步淘汰

    Sanger測序

    PCR-測序

    SNP位點,缺失突變

     

    時間長

    步驟多

    金標準

    無注冊證

    PCR-熒光染料法

    熒光PCR

    單個基因

    快速,簡便

    假陽性

    簡單一步

    核酸檢測

    PCR-熒光探針法

    Taqman

    SNP,多態性

    快速,簡便

    少數位點

    簡單一步

    普及

    液相芯片法

    PCR-液相雜交

    SNP, 多基因,多位點

     

    易污染

    步驟多

    較高

    非主流

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